Queen Med - Teste da fragilidade osmótica

TESTE DE FRAGILIDADE OSMÓTICA

Considerações iniciais

O Teste de Fragilidade Osmótica (F.O.) ou Curva de Fragilidade Osmótica ainda hoje é um método de triagem laboratorial muito utilizado para avaliar a resistência ou fragilidade (lise) dos eritrócitos quando submetidos a variações de concentrações osmóticas em cloreto de sódio.( Principalmente quando outros métodos mais modernos, como o de citometria de fluxo, não estão disponíveis de forma ampla em todo o território nacional.

Assim, a utilização do teste de F.O., ainda hoje, baseia-se no fato de se tratar de um método simples e de baixo custo, porém que também apresenta pouca precisão em função das muitas variáveis em sua execução, que vão desde erros operacionais na diluição das soluções de cloreto de sódio até a transferência de amostras trocadas no momento da leitura em espectrofotômetro. Além do tempo de execução da técnica, que é exclusivamente manual e exige operador dedicado.

Esses são alguns dos fatores determinantes para que muitos laboratórios de rotina brasileiros tenham deixado de oferecer esse teste em seu rol de exames. Assim, uma parcela importante de pacientes deixou de ser assistida de triagem e diagnóstico( para anemias de caráter genético (esferocitose hereditária, epilocitose hereditária, estomatocitose hereditária e piropoiquilocitose hereditária) que são associadas a deficiências, qualitativas ou quantitativas, de proteínas de ligação membrana celular e citoesqueleto (complexo juncional), como por exemplo nas anemias por deficiência das proteínas: banda 3, espectrina alfa, espectrina beta, anquirinas, banda 4.1, banda 4.2, demantina, actina, aducina, banda 6 e banda 7. Deficiências essas que interferem na integridade, flexibilidade, permeabilidade e/ou deformidade dos eritrócitos quando submetidos a concentrações osmolares diferentes.

As condições de deficiência de proteínas do complexo membrana celular/citoequeleto o teste de F.O. pode se apresentar aumentado em anemias, como na esferocítica hereditária, anemia hemolítica não-esferocítica hereditária e nas hemolíticas adquiridas após envenenamento, por exemplo. Por outro lado, o mesmo teste pode apresentar-se diminuído, por exemplo, nas anemias ferropriva, talassemias, doença falciforme e doença da hemoglobina C.

Contudo, durante a investigação dessas anemias o teste de F.O. é apenas mais um indicador para a conclusão diagnóstica, sendo necessários outros parâmetros laboratoriais para auxiliar nessa interpretação, como: o hemograma completo onde se observam alterações na concentração de hemoglobina, no hematócrito, no volume corpuscular médio (VCM), na concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM), na amplitude de distribuição dos eritrócitos (RDW) e ainda na análise morfológica do esfregaço sanguíneo, com a presença de diversas formas dos eritrócitos (poiquilocitose); e a contagem de reticulócitos que se apresenta aumentada (reticulocitose).

Nesse sentido, entre as anemias por deficiência de proteínas do complexo membrana celular/citoequeleto, a mais frequente é a esferocitose hereditária, que apresenta aumento da lise de eritrócitos no teste de F.O., reticulocitose, hemoglobina entre 8 e 13g/dL, VCM < 82fl, CHCM>25g/dL e esferócitos na hematoscopia.

ológicas

Coleta e preparação da amostra: uma amostra de sangue é coletada do paciente e preparada para teste.
Procedimento: No Teste de Fragilidade Osmótica, as hemácias do paciente são expostas a soluções com diferentes níveis de osmolaridade. Essas soluções criam um gradiente de concentração de água, fazendo com que a água entre ou saia das hemácias.
Observação da hemólise: Os eritrócitos afetados pela esferocitose hereditária apresentam maior fragilidade osmótica, o que significa que são mais suscetíveis à hemólise em soluções hipotônicas (menor osmolaridade). Isso resulta em uma liberação mais precoce e rápida de hemoglobina para a solução circundante.
Análise: O grau de hemólise é medido, normalmente por métodos espectrofotométricos. Em seguida, é traçado um gráfico que mostra a porcentagem de hemólise em relação às diferentes concentrações das soluções osmóticas. Este gráfico, conhecido como curva de fragilidade osmótica, é um indicador fundamental no diagnóstico de esferocitose hereditária.

As hemácias são colocadas em soluções salinas de diferentes concentrações (geralmente entre 0,85% e 0,0% NaCl).

Em soluções hipotônicas, a água entra nas hemácias → elas se distendem → até se romperem.
A concentração salina em que ocorre a hemólise indica a fragilidade da membrana eritrocitária.

Para o teste de fragilidade osmótica, as soluções de uso de cloreto de sódio (NaCl) foram confeccionadas a partir de uma solução estoque de NaCl, concentrada a 10% e tamponada em tampão fostato à pH 7,4, da qual foram feitas diluições, em água deionizada, para a confecção dos 13 frascos de 100mL de soluções de NaCl nas concentrações de 0,90%; 0,80%; 0,75%; 0,65%; 0,60%; 0,55%; 0,50%; 0,45%; 0,40%; 0,35%; 0,30%, 0,20%; e 0,10%.

Para a verificação da diferença qualitativa entre as amostras do teste de F.O. foram identificados 13 tubos secos de vidro (medindo 16×100), em duplicata, aos quais foram incluídos 5mL de solução de NaCl em diferentes concentrações seguido da adição de 20µL da amostra por tubo de cada paciente, tanto para as amostras a fresco como para as amostras processadas após incubação a 37°C em banho-maria por 24 horas. Posteriormente, esses tubos foram homogeneizados e postos em repouso por 30 minutos, em seguida centrifugados por 5 minutos a 3.000rpm. O sobrenadante de cada tubo foi transferido para cubetas para leitura em espectrofotômetro de luz com filtro de 540nm de comprimento de onda, para obtenção das concentrações do grau de hemólise de cada tubo e confecção das curvas de fragilidade osmótica.